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柯萨奇病毒CVA6型荧光定量RT-PCR试剂盒(染料法)图片
产品货号:
BTN14-80600
中文名称:
柯萨奇病毒CVA6型荧光定量RT-PCR试剂盒(染料法)
英文名称:
Coxsackie Virus(CVA6) SYBR qRT-PCR Kit
产品规格:
50次
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价
本产品是基于染料法荧光定量PCR原理开发。


专门检测柯萨奇病毒CVA6型变种的试剂盒。


  1. 一站式,用于不需要单独准备每种成分,包括引物和对照。
  2. 根据柯萨奇病毒CVA6型变种的保守基因序列设计的引物,具有良好的特异性。
  3. 基于染料法qRT-PCR检测,灵敏度比常规RT-PCR高10~100倍,可以达到至少1000拷贝/反应。
  4. 使用一管式qRT-PCR技术,RT和PCR两步在一个试管内完成,不需要中间转移样品,降低了操作误差和可能的污染。
  5. 本产品足够50次20μL体系的RT-PCR,只能用于科研,不能用于临床。



组分规格
2×qRT-PCR缓冲液500μL
10×qRT-PCR酶混合液100μL
ROX染料I,50×20μL
ROX染料II,50×20μL
荧光PCR专用模板稀释液1mL
柯萨奇病毒CVA6型变种染料法qRT-PCR引物混合液100μL
柯萨奇病毒CVA6型变种染料法qRT-PCR阳性对照(1×108拷贝/μL)50μL

保存:-20℃,有效期一年。


一、稀释阳性对照(以102~107这6个10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原。
  1. 标记6个离心管,分别为7,6,5,4,3,2。用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液,最好用带芯枪头,下同)。
  2. 在7号管中加入5μL 1×108拷贝/μL的阳性对照(本试剂盒提供),充分震荡1分钟,得1×107拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
  3. 换枪头,在6号管中加入5μL 1×107拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得1×106拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
  4. 换枪头,在5号管中加入5μL 1×106拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得1×105拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。


二、样品RNA的制备
  1. 如果有N个样品,必须设置N+2个提取,多出的一个是PC(样品制备阳性对照),一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL上步制备的阳性对照梯度稀释液中的第4号(浓度为1×104拷贝/μL,10μL相当于1万拷贝)再加上一定量的水作为制备的阳性对照(加水后其总体积跟样品一样,样品体积多少取决于所用试剂盒的要求)。可以用水作为制备的阴性对照。
  2. 用自选方法纯化N+2个样品的RNA,本试剂盒跟市场上大多数病毒RNA提取试剂盒兼容。可以选购本公司的柱式病毒RNA提取试剂盒,其使用手册可以从本公司网站www.bjbalb.com,通过搜索产品名称或产品货号BTN71001下载。


三、设置RT-PCR反应(20μL体系,在样品制备室进行)
  1. 如果做定量分析并且只做1次重复,则标记N+9个PCR管,其中N+2个用于上步得到的N+2个样品,1个用于PCR阴性对照,6个用于标准曲线。如果做定性分析,并且只做1次重复,则标记N+4个PCR管,其中N+2个用于上步得到的N+2个样品,1个用于PCR阴性对照(用水做模板),1个用于PCR阳性对照(用第4号阳性对照稀释液做模板)。下面只描述定量分析的步骤,定性分析只是把6个标曲反应缩减成1个,其余不变。
  2. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照,阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后最后加):
    成分样品管
    N+2个
    RT-PCR
    阴性对照
    RT-PCR阳性对照
    (2~7管)
    2×qRT-PCR缓冲液10μL10μL各10μL
    柯萨奇病毒CVA6型变种染料法qRT-PCR引物混合液2μL2μL各2μL
    50×ROX(见注)0.4μL0.4μL各0.4μL
    样品制备所得RNA模板(来自于第8步)5.6μL--
    稀释所得6个阳性对照(来自于第6步)--各5.6μL
    10×qRT-PCR酶混合液2μL2μL2μL
    注:
    需使用ROX染料I的机型:ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus。
    需使用ROX染料II的机型:ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的Chromo4、Opticon(II)Corbett Rotor Gene 3000。
    不需要使用ROX的机型:Thermal Cycle Dice Real Time System,LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene3000、RotorGene 6000。
  3. 上机后按下面参数进行RT-PCR(参数可能会因仪器不同而需优化)。
    过程温度时间
    RT(逆转录)50℃30min
    预变性95℃10min
    qPCR反应
    (40个循环)
    95℃15sec
    60℃1min(采集SYBR通道的荧光信号)
    按仪器预设程序进行熔解曲线分析


四、数据处理
  1. 如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的log值为横轴,以Ct值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品RNA浓度的log值,再推算出其浓度。
  2. 如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct值应该小于或等于30。对待测样品,如果其Ct大于或等于40则为阴性,如果小于或等于35则为阳性。如果在35~40之间,可结合熔解曲线判断,若样品的溶解温度与阳性对照相同,该样本判断为阳性,否则为阴性。




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